sgRNA的設(shè)計(jì)原則
1)sgRNA的長(zhǎng)度：S. pyogenes II型CRISPR系統(tǒng)(SpCas 9)一般為20nt。
2)sgRNA序列的堿基組成：基因特異的sgRNA 模板序列為位于PAM 序列前，PAM序列的特征為NGG (N可以為任意核苷酸)，所以選擇3'末端含有GG的sgRNA，這樣可以構(gòu)成PAM序列。同時(shí)，sgRNA的序列應(yīng)避免以4個(gè)以上的T結(jié)尾，GC%含量最佳為30%-70%(40%-60%)。
3)sgRNA的序列與On-target和Off-target的匹配數(shù)都應(yīng)盡可能的高，一般大于60，認(rèn)為是可用的。
4)如果構(gòu)建U6啟動(dòng)子或T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA的表達(dá)載體，需要考慮sgRNA的5'堿基為G或GG，來(lái)提高其轉(zhuǎn)錄效率。
5)全基因的脫靶效應(yīng)分析，需要考慮脫靶位點(diǎn)的錯(cuò)配堿基數(shù)，盡量不超過5個(gè)。
6)如果想要造成基因移碼突變，需要盡量靠近基因編碼區(qū)的ATG下游，盡量位于第一或第二外顯子上。
